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    了解和認(rèn)識(shí)胎牛血清,特殊加工工藝血清,您知道幾種?

    發(fā)布時(shí)間: 2021-08-18  點(diǎn)擊次數(shù): 10320次

    血清作用原理:

    正因?yàn)檠鍋?lái)源于動(dòng)物,含有細(xì)胞培養(yǎng)中所需的各種營(yíng)養(yǎng)(血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等),所以奠定了血清是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中最基本普遍試劑的基礎(chǔ)。血清通常用作細(xì)胞生長(zhǎng)的添加物,擁有多種功能和用途,如:富含大分子蛋白,低分子量的營(yíng)養(yǎng)素,作為氨基酸、碳水化合物、維生素的額外來(lái)源;提高介質(zhì)的緩沖能力;可結(jié)合或中和有毒成分;減少細(xì)胞氧化應(yīng)激,減少細(xì)胞凋亡;提供促進(jìn)生長(zhǎng)的因子,有助細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境。


    ▽ 成分表

    了解和認(rèn)識(shí)胎牛血清,特殊加工工藝血清,您知道幾種?



    血清通過牛齡進(jìn)行分類,可大致分為:

    胎牛血清(Foetal Bovine Serum,簡(jiǎn)稱FBS)、國(guó)產(chǎn)胎牛血清(并無(wú)明確定義,但通常用此命名)、新生牛血清(Newborn Calf Serum,簡(jiǎn)稱NBCS,或稱小牛血清)、成年牛血清(Adult Bovine Serum,簡(jiǎn)稱ABS)。

    不同牛齡血清所含的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子、激素及其他活性物質(zhì)等組分與比例不同。


    ▽ 比較

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    一、透析胎牛血清

    常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)需要添加血清來(lái)維持細(xì)胞的增殖能力,盡管血清可以滿足一般細(xì)胞培養(yǎng)需求,但在進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分優(yōu)化和標(biāo)記特定成分進(jìn)行研究的實(shí)驗(yàn)中,仍需要去除某些特定的成分,常用的去除方法有透析。透析是將血清循環(huán)通過中空纖維,并在血清中補(bǔ)充生理鹽水以維持滲透壓,移除分子量小于10,000Da的小分子,如氨基酸、葡萄糖、鹽離子和未結(jié)合的蛋白等。
    因此透析胎牛血清主要用于關(guān)注小分子濃度的特殊研究,包括:研究蛋白質(zhì)組學(xué),同位素標(biāo)記、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和報(bào)告基因分析、報(bào)告基因細(xì)胞系的篩選等。

    ①細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(簡(jiǎn)稱SILAC)

    這是一項(xiàng)以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),全稱為Stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC)。它將13C或15N標(biāo)記的氨基酸摻入到培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞,來(lái)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì),一般培養(yǎng)5-6代,細(xì)胞中的蛋白質(zhì)將都被同位素標(biāo)記。然后質(zhì)譜分析,即可比較經(jīng)過不同處理的細(xì)胞,其內(nèi)部蛋白質(zhì)豐度的變化。它還可用于正常細(xì)胞與病理狀態(tài)細(xì)胞二者的比較。為避免胎牛血清中天然氨基酸的干擾,這時(shí)就需要用到透析胎牛血清,以保證摻入細(xì)胞蛋白中的氨基酸均為標(biāo)記氨基酸(常采用賴氨酸或精氨酸)。

    ②工程細(xì)胞株的篩選

    以常見的工程細(xì)胞株CHO-DFGRˉ為例,該細(xì)胞自身缺乏二氫葉酸還原酶(DHFR),必須在添加了次黃(嘌)漂呤、胸腺嘧啶和甘氨酸的培養(yǎng)液中才能得以存活。如將含有目的基因與DHFR基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,則可以得到在不含上述添加劑的培養(yǎng)基上也能生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆。通過甲氨蝶呤(MTX)進(jìn)一步篩選,可進(jìn)一步得到能表達(dá)大量目的蛋白的細(xì)胞克隆。這時(shí)的胎牛血清由于不含有次黃(嘌)漂呤和胸腺嘧啶等,也常作為選擇培養(yǎng)基的一部分,參與陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的篩選。

    研究某些因子如核苷酸或微量元素如硒、鋅對(duì)某種類型細(xì)胞增殖、分化的影響。這時(shí)也需要用透析胎牛血清,以避免培養(yǎng)體系中天然存在的這些物質(zhì)的干擾。



    二、碳吸附胎牛血清

    在進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分優(yōu)化和標(biāo)記特定成分進(jìn)行研究的實(shí)驗(yàn)中,需要去除某些特定的背景成分,常用的去除方法有碳吸附,使用活性碳和右旋糖苷去除血清中的激素。

    活性炭能夠結(jié)合脂溶性分子,通過碳吸附可降低血清中許多激素及生長(zhǎng)因子的濃度,如雌二醇、皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、孕酮、B類維生素、睪酮及T3、T4、前列腺素等。該血清適用于上述一些分子可能干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的實(shí)驗(yàn)中,對(duì)于那些需要這些分子的細(xì)胞培養(yǎng),也可能降低細(xì)胞生長(zhǎng)性能。

    碳吸附胎牛血清用于體外培養(yǎng),去除背景值以驗(yàn)證激素的作用效果,研究包括醇類受體連接,細(xì)胞受體類固醇調(diào)節(jié),各種組織激素分泌和甲狀腺激素功能。

    適用于:培養(yǎng)干細(xì)胞、原代細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、人類癌細(xì)胞、人類骨髓細(xì)胞、白血病細(xì)胞、人類胚肺成纖維細(xì)胞、人類腦神經(jīng)細(xì)胞和瘤細(xì)胞等細(xì)胞。



    三、去外泌體胎牛血清

    外泌體由分泌性細(xì)胞分泌,存在于所有的生物體液中,包括血液、尿液、唾液、乳汁和腦脊液中。它們隨后被其他細(xì)胞吸收并發(fā)揮生物活性。


    了解和認(rèn)識(shí)胎牛血清,特殊加工工藝血清,您知道幾種?

    △外泌體


    胎牛血清中含有大量的外泌體,但在外泌體研究中,如果仍然使用胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞,并通過收集上清液來(lái)提取外泌體進(jìn)行實(shí)驗(yàn),那么胎牛血清中本身的牛源外泌體將會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)分析造成極大的干擾。去外泌體血清是將由無(wú)菌采集的健康胎牛血清經(jīng)過過濾,去除≥99%的胎牛血清內(nèi)源外泌體,還可使細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)與未處理的胎牛血清具有相同的增殖速率和形態(tài)。

    因此,去外泌體血清主要用于細(xì)胞體外的增殖培養(yǎng),收獲目標(biāo)細(xì)胞的外泌體。



    四、四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)胎牛血清

    普通胎牛血清中一般會(huì)含有四環(huán)素(Tet),當(dāng)使用非常敏感的Tet-誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)時(shí),研究人員往往會(huì)遇到非預(yù)期的基因表達(dá)的問題,為了確保精確地基因表達(dá),建議使用四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)胎牛血清,應(yīng)用于使用敏感四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)(Tet-on, Tet-off),以及其它對(duì)四環(huán)素敏感的實(shí)驗(yàn)中。



    五、低IgG胎牛血清

    IgG是胎牛血清中發(fā)現(xiàn)的最常見的抗體,低IgG血清主要通過A-Sepharose處理,使血清能夠保留原有的生物活性,同時(shí)降低血清的IgG含量,低于5μg/ml。低IgG胎牛血清適用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。
    因此,低IgG胎牛血清有利于單克隆抗體的純化,用于研究抗體和病毒反應(yīng)、細(xì)胞表面抗原表位。



    六、去脂胎牛血清

    去脂胎牛血清通過固體基質(zhì)脫脂作用去除內(nèi)源性脂類、甘油三酯和膽固醇,含量?jī)H為標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的1/3。

    去脂胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中用量較多,其含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成分,常用于動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng),具有極為重要的功能。

    ①提供對(duì)維持細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)的激素,基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營(yíng)養(yǎng)物以及主要的低分子營(yíng)養(yǎng)物。

    ②提供結(jié)合蛋白,能識(shí)別維生素、脂類、金屬和其他激素等,能結(jié)合或調(diào)變它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。

    ③有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱源質(zhì)結(jié)合,起到解毒作用。

    ④是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基上所需因子來(lái)源。

    ⑤起酸堿緩沖液作用。

    ⑥提供蛋白酶抑制劑,使在細(xì)胞傳代時(shí)剩余胰蛋白酶失活,保護(hù)細(xì)胞不受傷害。

    去脂胎牛血清可用于蛋白激酶CK2-α’與腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究:

    ①蛋白激酶是酶類這個(gè)家族中最龐大的一員,被用來(lái)完成蛋白磷酸化作用的催化,這是控制細(xì)胞生命活動(dòng)中最通常的機(jī)制。其中*有效性的蛋白激酶之一可能就是CK2。蛋白激酶CK2(protein kinase CK2, PKCK2),過去曾經(jīng)被稱為酪蛋白激酶-2或Ⅱ(cascin kinase2 or Ⅱ)。它是由兩個(gè)催化亞基(aa’)和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基(ββ)構(gòu)成的不均一四聚體。

    ②蛋白激酶CK2是由兩個(gè)分別為42—44KDa和38KDa的aa’ββ型異四聚體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定,在體外只有在變性的條件下才能被解離。除了細(xì)胞基質(zhì),一些病毒蛋白也被CK2所磷酸化。蛋白激酶CK2在轉(zhuǎn)錄、信號(hào)、增殖,并且在導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的各細(xì)胞步驟中發(fā)揮作用。



    七、熱滅活系列血清

    加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。啟動(dòng)的補(bǔ)體系統(tǒng)參與溶解細(xì)胞事件,刺激平滑肌收縮,細(xì)胞和血小板釋放組胺,啟動(dòng)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化。在免疫學(xué)研究中,培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí),推薦使用熱滅活血清。
    實(shí)驗(yàn)顯示,熱滅活血清對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是非必需的,對(duì)于非必須的細(xì)胞來(lái)說血清滅活對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)只有微小甚至無(wú)任何作用,還可能造成生長(zhǎng)速率降低,沉淀物還會(huì)顯著增多,不利于細(xì)胞觀察。因此,若非必須,不需要對(duì)血清進(jìn)行滅活處理。
    如若需要使用熱滅活血清,可通過提高血清溫度到56℃,并且保持該溫度30分鐘完成。建議加放空白對(duì)照(同體積水)使用溫度計(jì)測(cè)溫,以測(cè)得溫度為56℃時(shí)為計(jì)時(shí)起始點(diǎn),加熱中可不時(shí)輕度旋轉(zhuǎn)混勻血清。



    ☆ 血清的使用方法

    血清從冰凍區(qū)中取出后(切勿直接將血清從-20℃置入37℃解凍,這樣因溫度改變太大,容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀),放置于2℃~8℃中使之融化,解凍過程中間歇地輕輕搖晃均勻,待全部溶解后再分裝或直接使用。*融解的血清從4℃拿出,按要求比例(5%-20%)加基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置成*培養(yǎng)基,建議使用不完時(shí),置于4℃冰箱存放并于1-2周內(nèi)用完。



    ☆ 使用血清時(shí)的注意事項(xiàng)

    血清沉淀的物質(zhì)主要有:纖維蛋白(絮狀沉淀),脂蛋白,冷凝集素,玻連蛋白,胎球蛋白,磷酸鈣(顯微鏡下小黑點(diǎn)沉淀),膽固醇等。

    哪些原因容易導(dǎo)致血清沉淀:

    1、溫度改變太大,血清由-20℃直接放入37℃解凍,因溫度改變劇烈容易導(dǎo)致沉淀。

    2、血清在室溫或4℃冰箱放置時(shí)間太久,血清中的不穩(wěn)定成分會(huì)被破壞,影響細(xì)胞生長(zhǎng)效果;導(dǎo)致血清品質(zhì)變差,也會(huì)產(chǎn)生沉淀。

    3、血清分裝凍存時(shí),注意在不產(chǎn)生氣泡的情況下?lián)u晃均勻,避免因血清成分濃度改變產(chǎn)生沉淀。

    4、血清滅活后容易產(chǎn)生沉淀,如需使用滅活血清,請(qǐng)按56℃,30分鐘,輕微搖晃原則操作,滅活溫度過高、時(shí)間過長(zhǎng)、搖晃不均都容易產(chǎn)生沉淀。

    5、如有血清沉淀,分裝后進(jìn)行離心處理,建議400g離心5分鐘,取上清使用。



    結(jié)語(yǔ):

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