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    PCR實驗耗材你選對了嗎？

    發(fā)布時間： 2021-08-19　　點擊次數(shù)： 3322次

    聚合酶鏈?zhǔn)皆谀姆磻?yīng)？


    Polymerase Chain Reaction


    PCR實驗耗材你選對了嗎？



    聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

    什么是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)？

    聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一項用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它是在DNA聚合酶和核苷酸底物共同參與下，將該段DNA擴增至足夠數(shù)量，以便進行結(jié)構(gòu)和功能分析。

    PCR實驗耗材你選對了嗎？


    影響PCR實驗的因素之一 —— 耗材

    在PCR實驗中，影響擴增效果的因素有很多。我們能想到的有dNTP的質(zhì)量與濃度、模板核酸的量與純化程度、引物的設(shè)計、DNA聚合酶的濃度、擴增長度等問題。

    實際上，使用的耗材也可能會影響實驗結(jié)果，而這往往被我們所忽略。因此在選擇實驗耗材前，我們還需要了解PCR耗材相關(guān)的特性和術(shù)語。


    如何選擇合適的PCR耗材

    1、原材料

    PCR/qPCR耗材一般都是聚丙烯（PP）材質(zhì)。

    因其為生物學(xué)惰性材料，表面不易粘附生物分子，且有著良好的化學(xué)耐性，及溫度耐受性 （可121℃高壓滅菌，也可以承受熱循環(huán)過程中的溫度變化）。這些材料通常會與試劑或者樣品直接接觸，因而在生產(chǎn)制備過程中需要選用高質(zhì)量的材料和良好的加工工藝。


    2、選擇合適的容積

    PCR管的體積規(guī)格大多數(shù)都可以滿足PCR反應(yīng)要求。但是在滿足實驗要求的基礎(chǔ)上，優(yōu)先推薦選用低容管。因為低容反應(yīng)管/板有著較小的上方空間，可提高熱傳導(dǎo)率并降低蒸發(fā)。而且在加樣時，需要避免加樣過量或過少。過量會導(dǎo)致熱傳導(dǎo)率下降，溢出及交叉污染，而加樣過少可能會造成樣品蒸發(fā)損失。

    大家可依據(jù)具體的實驗要求選用合適的產(chǎn)品。


    PCR實驗耗材你選對了嗎？

    品牌：鋼士特GUNSTER(中國臺灣)

    名稱：PCR八聯(lián)排管(管蓋分離)

    貨號：MB-P08B

    規(guī)格：0.2ml  平蓋




    PCR實驗耗材你選對了嗎？

    品牌：鋼士特GUNSTER(中國臺灣)

    名稱：PCR八聯(lián)排管(管蓋分離)

    貨號：MB-P08D

    規(guī)格：0.2ml  凸蓋




    PCR實驗耗材你選對了嗎？

    品牌：鋼士特GUNSTER(中國臺灣)

    名稱：PCR 96孔板

    貨號：MB-P96

    規(guī)格：0.2ml  無裙邊  透明




    3、PCR管管蓋的選擇

    平蓋與凸蓋各有優(yōu)勢：

    平蓋可為qPCR提供精確的熒光信號傳遞；便于書寫標(biāo)記；合蓋容易，密封性好，易于操作。

    凸蓋與PCR儀熱蓋接觸，減少壓力引起的反應(yīng)管變形，更好的防止液體蒸發(fā)。但會影響熒光信號傳遞，無法應(yīng)用于qPCR實驗。



    4、96孔板裙邊的選擇

    無裙邊板：可適用于大多數(shù)的PCR儀或qPCR儀，但不適用于自動化、應(yīng)用。移液過程中穩(wěn)定性不高，需要配合板托使用。

    半裙邊板：可適配標(biāo)簽或應(yīng)用條碼，適合自動化應(yīng)用，且有著較好的移液穩(wěn)定性。

    全裙邊板：非常適用于自動化實驗應(yīng)用，也可適配標(biāo)簽及應(yīng)用條碼。機械強度較好，可適用于凸出模塊的PCR儀，且移液過程中穩(wěn)定性高。



    5、根據(jù)實驗選擇耗材

    根據(jù)檢測方法的不同，耗材的選擇也不同。

    PCR實驗分為普通PCR法和熒光定量PCR法。普通PCR法一般是終點PCR跑膠法測定，所以所用耗材的導(dǎo)熱性和密封性和實驗結(jié)果有著密不可分的關(guān)系；而熒光定量PCR是實時檢測熒光信號，除了導(dǎo)熱性和密封性外，對透光性和避光性也有所要求。

    簡而言之，做熒光定量PCR的耗材也可以做普通PCR，反之則不行。


    導(dǎo)熱性

    導(dǎo)熱性越好越均一，PCR的速度就越快，準(zhǔn)確度也越高。


    密封性

    密封性越好，產(chǎn)物的揮發(fā)越少，得到的產(chǎn)物就越多，同時氣溶膠的產(chǎn)生也越少，對于下一輪實驗的污染也就越少，也就意味著假陽性的產(chǎn)生率越低。


    避光性

    這是針對熒光定量而言的，如果我們在整個實驗過程中沒注意避光，帶有熒光的試劑過度被消耗，那直接就會影響我們實驗的擴增效率，導(dǎo)致產(chǎn)生不準(zhǔn)確的結(jié)果。


    透光性

    這也是對于熒光定量而言，我們知道它是一種實時定量的方式，那么耗材本身的透光性就直接關(guān)系到我們檢測到的熒光信號多少。如果選擇耗材透光性良好，需要檢測到的信號就會變得微弱，那就會造成我們對結(jié)果的誤判。所以對于熒光定量而言，白色PCR板效果優(yōu)于透明PCR板。



    PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用

    單克隆抗體技術(shù)曾使免疫學(xué)理論與實踐有了新的突破，近幾年來PCR技術(shù)使分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科發(fā)生了一次方法學(xué)的革命。在不到10年的時間內(nèi)，在以下幾個領(lǐng)域中PCR技術(shù)已具有實用價值，且其應(yīng)用范圍正在不斷擴大中。


    1、遺傳病的產(chǎn)前診斷

    用胎兒羊膜細胞，羊水或甚至母血可以檢查胎兒的性別，這在與性染色體關(guān)聯(lián)遺傳病診斷中是必要的。對于高發(fā)的遺傳病，如地中海貧血、鐮刀狀細胞貧血、凝血因子缺乏、DMD等已在臨床應(yīng)用多年，為優(yōu)生優(yōu)育作了貢獻，對于有遺傳傾向的疾病尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂癥、甚至腫瘤中的一部分，均是當(dāng)前研究的重點，近期內(nèi)可望有突破。


    2、致病病原體的檢測

    這些外源入侵的基因，一旦闡明其部分核酸序列，就可以設(shè)計引物或探針，用PCR、PT-PCR或雜交方法來檢測，其范圍包括細菌、病毒、原蟲及寄生蟲、霉菌、立克次體、衣原體和支原體等一切微生物，PCR診斷的特點是可以選擇其基因中的保守區(qū)作通用檢測，也可以選定差異較大的基因部位作分型檢測。既可以做一病原體的專用檢測，也可以將有關(guān)病毒、細菌中不同的品種作一次多元檢測。而且檢測的靈敏度和特異性都遠高于當(dāng)前的免疫學(xué)方法，所需時間也已達到臨床要求，這對于難于培養(yǎng)的病毒（乙肝），細菌（如結(jié)核、厭氧菌）和原蟲（如梅毒螺旋體）等來說尤為適用。


    3、癌基因的檢測和診斷

    雖然對癌基因的研究大部分還屬于基礎(chǔ)階段，但癌變是由基因變異所導(dǎo)致的這一基本事實已無庸置疑，所以癌基因、抗癌基因入抗轉(zhuǎn)移基因的研究，離開分子水平的診斷手段是無法進行的，臨床上已可應(yīng)用的例子有白血病殘留細胞的定量（包括慢粒和急粒），肺癌中P53及Rb等抗癌基因的失活，神經(jīng)質(zhì)瘤N-myc基因的激活和表達。通過原位雜交觀察特定癌基因及抗轉(zhuǎn)移基因的植入和反義寡核苷酸對強表達癌基因的阻斷均已成為近代基因治療的著眼點。


    4、DNA指紋、個體識別、親子關(guān)系鑒別及法醫(yī)物證

    這一部分所矚目的課題已經(jīng)在某些國家取得法律認可。肌紅蛋白小衛(wèi)星基因，β-珠蛋白基因、ApoB基因等的多肽性和重復(fù)次數(shù)的差異都被應(yīng)用于鑒定，其靈敏度已達到一根頭發(fā)、一個細胞取得個體特征圖譜，這一領(lǐng)域也已發(fā)展到骨髓或臟器移植配型及動物種系的研究中。


    5、動、植物檢疫

    靈敏、特異、快速診斷檢測方法是我國進出口口岸的門衛(wèi)，檢查出入國境的人員、動、植物（種畜、種籽）等是否攜帶烈性傳染?。ò?、動物病毒、植物病毒等）病原體，食品、飼料等是否帶沙門氏菌等均需要基因診斷手段將這些病菌拒之于國境之外，是提高我國綜合國力的必要保證。


    6、高科技生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

    在轉(zhuǎn)基因動植物中檢查植入基因的存在。PCR技術(shù)尚可應(yīng)用于基因拼接、測序等領(lǐng)域。





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