酶切，作為一種常用的分子克隆的手段，如果應(yīng)用得當(dāng)，可謂寶刀屠龍，無(wú)往而不利；如果應(yīng)用不當(dāng)，又會(huì)步步維艱。真是讓人歡喜讓人憂愁。酶切，最常見(jiàn)的問(wèn)題就是切不動(dòng)和切過(guò)了。這些問(wèn)題比較復(fù)雜。下面，先講一講切不動(dòng)的問(wèn)題。

切不動(dòng)可能的原因：

1. 酶不匹配

解決的方法：如果是雙酶切 A 和 B，預(yù)實(shí)驗(yàn)中必須做 A 和 B 各自的單酶切和 A+B 的雙酶切, 好確認(rèn)這幾種酶都好用，質(zhì)粒上的切點(diǎn)都好用。

2. 體系的問(wèn)題

解決的方法：酶切盡量用大體系，如 50ul、100ul 等。大體系能稀釋內(nèi)切酶包裝中的甘油，對(duì)反應(yīng)有利。

3. 酶的量太少

解決的方法：當(dāng)設(shè)計(jì)一個(gè)酶切時(shí)，限制性內(nèi)切酶的用量是與 DNA 分子的大小和量密切相關(guān)的。根據(jù)每種酶的單位定義，精確計(jì)算出所需的限制性內(nèi)切酶的量。不要簡(jiǎn)單的套用酶說(shuō)明書(shū)中的“通用酶切方案“，那個(gè)通用酶切方案是很多酶切切不動(dòng)的原因。這里，小編隆重推薦一款酶切利器：3D(Double Digestion Designer)。該軟件的一個(gè)主要功能就是根據(jù)不同限制性內(nèi)切酶的單位定義，以及你底物 DNA 分子的大小以及 DNA 的量（ug數(shù)）來(lái)精確計(jì)算出*酶切你的 DNA 底物所需要的酶量，為*酶切提供夯實(shí)保證。

4. 酶失活 

如果限制性內(nèi)切酶因?yàn)楸９懿划?dāng)，導(dǎo)致酶失活或部分失活，那么依據(jù) 3D 計(jì)算出來(lái)的酶量就不能保證*酶切。解決的方法：保管好你的酶。如果過(guò)期了，就不要用了。

5.DNA 的問(wèn)題 

如果制備的質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量不好（如細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，質(zhì)粒制備時(shí)裂解不充分或裂解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等），那么對(duì)這種質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行酶切時(shí)，即使酶活性正常，酶量足夠，也不能實(shí)現(xiàn)*酶切，因?yàn)槠渲泻芏噘|(zhì)粒 DNA 已經(jīng)變性，不能被切開(kāi)。

下面，給大家看一個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)例。 

如果要用 AcsAB + pSB1C3 對(duì)質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行雙酶切，以便進(jìn)行某基因的克隆。 

那么，應(yīng)該同時(shí)設(shè)計(jì)并進(jìn)行三種酶切反應(yīng)：

A: AcsAB + pSB1C3 雙酶切 

B: AcsAB 單酶切 

C: pSB1C3 單酶切 

在酶切時(shí)，A，B，C 三種酶切反應(yīng)都用相同的 buffer 系統(tǒng)，相同的 DNA 量（建議至少 0.5ug），所需的酶量用 3D 進(jìn)行計(jì)算。在合適的溫度（37°C）酶切 1～2 個(gè)小時(shí)，然后進(jìn)行電泳分析。電泳分析時(shí)，添加兩種對(duì)照：未酶切的質(zhì)粒 DNA 和分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）。

根據(jù)電泳的結(jié)果，就可以知道酶切是否*：

如果一切正常，*酶切后電泳的條帶分布如下： 

1.單酶切(B 和 C)應(yīng)該只有一條線性化的 DNA 條帶，其大小與質(zhì)粒的理論長(zhǎng)度一致； 

2.未進(jìn)行酶切的質(zhì)粒 DNA 應(yīng)該主要是一條超螺旋條帶，其電泳位置應(yīng)該在單酶切產(chǎn)生的線性 DNA 分子的前面。(有的質(zhì)粒會(huì)在超螺旋條帶的后面出現(xiàn)線性化條帶和環(huán)狀 DNA 條帶）； 

3.雙酶切的條帶應(yīng)該只有一條帶，而且大小與單切的位置一樣(注意：只有當(dāng)兩個(gè)酶切位點(diǎn)間沒(méi)有大片段插入時(shí)，才如此。事實(shí)上，大部分質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)都是如此)。

如果出現(xiàn)以下的情況，就表明有問(wèn)題： 

1.單酶切后（B 和/或 C），與未酶切的 DNA 樣品(D)的電泳位置一樣（即依然為超螺旋） 

2.出現(xiàn)線性化質(zhì)粒及超螺旋質(zhì)粒兩條帶。這意味著：AcsAB 和/或 pSB1C3 未能*切開(kāi)，原因可能是酶部分失活，或者質(zhì)粒的質(zhì)量有問(wèn)題。此時(shí)，即使雙酶切只出現(xiàn)一條線性化 DNA 條帶，也可能在線性化質(zhì)粒中存在大量的單酶切的載體。 用此種載體進(jìn)行克隆，則在連接時(shí)會(huì)出現(xiàn)大量的單酶切載體的自連（載體自連的效率較雙片段連接高 10 倍以上），導(dǎo)致大量的自連克隆，很難挑選到有插入的克?。寺∈。?。如果出現(xiàn)此種現(xiàn)象，建議不要盲目地做下去。應(yīng)該先停一停，首先逐一查找可能的原因。只有當(dāng)上述兩種可能的問(wèn)題都解決了，才能保證*酶切，進(jìn)而獲得正確的克隆。

以上是酶切的常規(guī)經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)然還是會(huì)有特例比較難做，因?yàn)槠渲猩婕暗矫噶康挠?jì)算，Buffer 的選擇，反應(yīng)體積，反應(yīng)條件等多種條件摸索。一旦出現(xiàn)問(wèn)題，大家需要耐心細(xì)致，逐一查找可能的原因。