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    實(shí)驗(yàn)操作分享：干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨實(shí)驗(yàn)

    發(fā)布時(shí)間： 2021-10-08　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2464次

    間充質(zhì)干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，可在體外通過不同的方法干預(yù)下下誘導(dǎo)分化為骨、軟骨及其他結(jié)締組織，因其來源廣泛，分離無創(chuàng)傷，較低的免疫原性、生長周期短等特點(diǎn)，是組織工程種子細(xì)胞的重要來源。

    干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化一方面是干細(xì)胞鑒定的主要方法，另一方面也是干細(xì)胞功能學(xué)研究的主要途徑。采用體外條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下，人間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)能夠分化為成脂肪、骨、軟骨細(xì)胞。成骨分化經(jīng)茜素紅染色法鑒定。


    實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

    試劑：

    PBS，成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，茜素紅

    耗材：

    NEST細(xì)胞培養(yǎng)皿，NEST普通吸頭，NEST微量離心管

    設(shè)備：

    CO2培養(yǎng)箱，顯微鏡


    一、接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

    取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按照2×105cells/cm2的細(xì)胞密度接種至包被后的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)皿放到37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞增殖狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)60-70%時(shí)，棄掉上清，加入成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。

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    二、細(xì)胞分化誘導(dǎo)

    每2-3天進(jìn)行換液（定期觀察是否有污染），再放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2-3周，并注意觀察細(xì)胞形態(tài)變化。根據(jù)細(xì)胞鈣鹽結(jié)晶析出和鈣質(zhì)結(jié)節(jié)形成的情況，決定終止細(xì)胞誘導(dǎo)的時(shí)間，進(jìn)行下一步染色鑒定。

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    三、細(xì)胞固定

    用吸頭（確保吸取充分）吸去培養(yǎng)基使用適量1×PBS清洗一次，棄去后取適量4%中性甲醛溶液細(xì)胞培養(yǎng)皿底面，室溫固30-60min，棄去固定液再使用1×PBS清洗兩次。


    四、茜素紅染色

    加入適量茜素紅染液染3-5min，吸去茜素紅染液，用1×PBS清洗兩次，并加入適量1×PBS避免細(xì)胞干燥。


    五、誘導(dǎo)評估

    顯微鏡下觀察成骨染色效果，并進(jìn)行圖像采集和誘導(dǎo)評估。誘導(dǎo)成功時(shí)，鈣質(zhì)結(jié)節(jié)會(huì)與茜素紅染料結(jié)合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色。

    實(shí)驗(yàn)操作分享：干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨實(shí)驗(yàn)

    圖c 間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化,茜素紅染色顯示鈣結(jié)節(jié)




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