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    細胞轉(zhuǎn)染實驗技術(shù)——功能實驗的第一步

    發(fā)布時間： 2021-10-21　　點擊次數(shù)： 2088次

    轉(zhuǎn)染(transfection)是真核細胞主動或被動導(dǎo)入外源核酸片段（DNA或RNA）而獲得新的表型的過程。轉(zhuǎn)染后的細胞會產(chǎn)生重組蛋白，或者特異性的增強/抑制細胞中的基因表達。轉(zhuǎn)染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測。一定時間后收集轉(zhuǎn)染處理后的細胞，采用超聲或酶解的方法破碎細胞，離心得到上清。針對基因水平，使用普通 PCR 或 RT-PCR 進行驗證，蛋白水平，使用 western blot 檢測，簡單，快速，準確。

    細胞轉(zhuǎn)染實驗技術(shù)——功能實驗的第一步

    轉(zhuǎn)染的類型

    根據(jù)導(dǎo)入的核酸存在于宿主細胞的時間長短，可以分為瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)。根據(jù)轉(zhuǎn)染方式可以分為化學(xué)方法，生物方法，物理方法。

    瞬時轉(zhuǎn)染是指將構(gòu)建好的質(zhì)?；蛘遱iRNA通過某種方式導(dǎo)入到哺乳動物細胞內(nèi)（常用的工具細胞 HEK293 細胞），該外源核酸片段不整合到細胞自身的基因組上。隨著細胞的生長分裂，外源基因會逐漸丟失，在細胞內(nèi)能夠存在 3-4 天，無法隨著細胞的分裂進入到子代細胞中。在這一段時間內(nèi)，外源基因在細胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)錄翻譯，得到少量的蛋白。根據(jù)使用的載體不同，收集目的基因/蛋白進行檢測的時間不同，通常在轉(zhuǎn)染后48h，目的蛋白的表達水平最高。瞬時轉(zhuǎn)染的特點是短時間內(nèi)進行蛋白的小量制備，滿足后續(xù)的實驗要求。

    穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是外源DNA整合到細胞基因組中，成為細胞基因組的一部分從而得以復(fù)制，隨著細胞分裂，子代細胞也同樣表達外源基因，這就是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的標志。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是建立在瞬時轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上的，先對細胞進行轉(zhuǎn)染，再對得到的細胞池進行篩選，篩選標記是抗生素，熒光報告基團等，通常需要2-3周的篩選時間，由此形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的特點是能夠得到蛋白的大量、長期生產(chǎn)，滿足后續(xù)的一系列體內(nèi)體外的表型實驗。

    轉(zhuǎn)染方式

    考慮到轉(zhuǎn)染效率是影響細胞實驗的重要因素，因此選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方式很關(guān)鍵。下面我們介紹一下常見的轉(zhuǎn)染方式。

    細胞轉(zhuǎn)染實驗技術(shù)——功能實驗的第一步

    細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成，對于也帶負電荷的核酸片段（DNA和RNA）來說是不可透過的屏障，因此研究人員開發(fā)了很多方法能使核酸穿透細胞膜進入胞內(nèi)，大致分為三類：

    轉(zhuǎn)染方法

    原理

    優(yōu)點

    缺點

    化學(xué)轉(zhuǎn)染方法

    陽離子脂質(zhì)體

    脂質(zhì)體是一種人工的脂雙層膜。陽離子脂質(zhì)體通常由陽離子和兩性離子脂質(zhì)組成。在DNA與脂質(zhì)體形成lipoplex的過程中，陽離子脂質(zhì)體起到復(fù)合和凝集DNA的作用，同時也有助于復(fù)合物與細胞膜的結(jié)合

    操作簡單快速；

    轉(zhuǎn)染效率高且重復(fù)性好；

    可用于轉(zhuǎn)染DNA、RNA和蛋白；

    可用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

    會受到血清的抑制，降低轉(zhuǎn)染效率；

    脂質(zhì)體中的核心組分對細胞毒性較大

    磷酸鈣共沉淀

    核酸以磷酸鈣-DNA 共沉淀物的形式出現(xiàn)時，可使DNA 附在細胞表面，利于細胞吞入攝取，或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內(nèi)

    便宜，使用廣泛

    轉(zhuǎn)染效率差，不穩(wěn)定；

    細胞毒性大；

    葡聚糖

    它是一種陽離子聚合物，可以與帶負電荷的DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合，進而被細胞吞噬

    多用于貼壁細胞

    一些細胞類型對葡聚糖特別敏感，可能會發(fā)生形態(tài)變化或者抑制細胞生長

    其他陽離子聚合物

    帶正電的聚合物與核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的復(fù)合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過內(nèi)吞作用進入細胞。陽離子聚合物和陽離子脂質(zhì)體最大的區(qū)別在于陽離子聚合物不含疏水部分而*溶于水，可以方便地進行化學(xué)修飾，且不會像脂質(zhì)體一樣破壞細胞結(jié)構(gòu)，所以相對毒性較低。目前使用*泛的陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑是PEI（聚乙烯亞胺）

    成本低；

    免疫原性低；

    轉(zhuǎn)染效率高且穩(wěn)定；

    適用于懸浮細胞或貼壁細胞

     

     

    細胞毒性較大；

    常用于瞬時轉(zhuǎn)染；

    不能生物降解

    物理轉(zhuǎn)染方法

    電穿孔

    利用高脈沖電壓破壞細胞膜電位，使得DNA 通過膜上形成的小孔導(dǎo)入穩(wěn)定/瞬時性轉(zhuǎn)染

    適用所有細胞類型；

    適用瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；

    不需要載體

    需要一定的電轉(zhuǎn)設(shè)備；

    需要優(yōu)化電轉(zhuǎn)脈沖和電壓參數(shù)；

    細胞致死率高；

    DNA和細胞用量大

    顯微注射

    利用管尖極細（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細胞中

    適用所有細胞類型；

    可進行單細胞轉(zhuǎn)染；

    不需要載體；

    不限制轉(zhuǎn)入的基因大小和數(shù)量；

    多用于轉(zhuǎn)基因

    設(shè)備昂貴；

    技術(shù)要求高；

    細胞致死率高

    生物轉(zhuǎn)染方法

    病毒轉(zhuǎn)染

    病毒該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達

    轉(zhuǎn)染效率高；

    適用于難轉(zhuǎn)染的細胞系；

    可用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染

    周期長，程序復(fù)雜；

    費用相對高；

    存在生物安全問題

    細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成，對于也帶負電荷的核酸片段（DNA和RNA）來說是不可透過的屏障，因此研究人員開發(fā)了很多方法能使核酸穿透細胞膜進入胞內(nèi)，大致分為三類：

    轉(zhuǎn)染的影響因素：

    轉(zhuǎn)染過程中許多因素會影響轉(zhuǎn)染效率：如細胞類型；細胞密度；質(zhì)粒大小、質(zhì)粒純度；血清；轉(zhuǎn)染試劑等。轉(zhuǎn)染實驗中，以下幾個因素進行調(diào)整和優(yōu)化：

    1. 轉(zhuǎn)染前的細胞狀態(tài)和密度

    轉(zhuǎn)染時細胞密度以 50-80%最佳，細胞密度過高會嚴重影響細胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率（周期進程阻滯，凋亡增加等）。同時支原體污染會嚴重降低細胞的轉(zhuǎn)染效率，因此轉(zhuǎn)染前可用環(huán)丙沙星處理細胞以除去支原體。

    2. 轉(zhuǎn)染時的質(zhì)粒純度

    如果提取的質(zhì)粒不純，如帶少量鹽離子，蛋白、代謝物污染等都會顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成；而含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對細胞存在很大的毒性作用（一般用去內(nèi)毒素的提取試劑盒）?？股匾话銓φ婧思毎麩o毒，但轉(zhuǎn)染過程中細胞通透性增加，會使抗生素進入細胞，從而降低細胞活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。

    3. 轉(zhuǎn)染后的篩選時間

    轉(zhuǎn)染后篩選不能太早或太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷大，增殖較慢，太晚會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆。一般要在轉(zhuǎn)染后48h之后開始加抗生素篩選。

    4. DNA 與轉(zhuǎn)染試劑的比例

    許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化 DNA 與轉(zhuǎn)染試劑的比例。不同細胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率差別很大，通常需要根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書進行預(yù)實驗，選擇合適濃度的外源DNA或RNA，調(diào)整外源核酸片段和轉(zhuǎn)染試劑的比例。


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