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    核酸提取的方法

    發(fā)布時(shí)間： 2021-10-22　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1578次

    核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作。

    核酸提取系列目錄

    一、DNA提取方法簡(jiǎn)介

    二、DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策

    三、RNA提取方法簡(jiǎn)介

    四、RNA提取及其RT-PCR常見(jiàn)問(wèn)題、原因分析及其對(duì)策


    一、DNA提取方法簡(jiǎn)介

    1、基因組DNA的提取

    1.1、CTAB法

    1.2、SDS法

    1.3、其它

    2、非基因組DNA的提取

    2.1、質(zhì)粒DNA的提取

    2.1.1、堿裂解法

    2.1.2、煮沸法

    2.2、線粒體、葉綠體DNA的提取

    差速離心結(jié)合SDS裂解法

    1、基因組DNA的提取

    1.1、CTAB法

    CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三呷基溴化銨)，是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。

    具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里。

    該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。

    注：CTAB溶液在低于15℃ 時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15℃。


    CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

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    Tris-HCl （pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；
    EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；
    NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP（脫氧核糖核蛋白 ）；
    CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；
    β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。

    CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方
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    PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。

    PVP（聚乙烯吡咯烷酮）
    PVP 按其平均分子量大小分為四級(jí)，習(xí)慣上常以K值表示，不同的K值分別代表相應(yīng)的PVP平均分子量范圍。K值實(shí)際上是與PVP水溶液的相對(duì)粘度有關(guān)的特征值，而粘度又是與高聚物分子量有關(guān)的物理量，因此可以用K值來(lái)表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越強(qiáng)。
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    在研磨過(guò)程中加入PVP，其中的CO-N=基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚的能力，從源頭上減少了酚類(lèi)被氧化的機(jī)會(huì)。
    同時(shí)向抽提液中加入還原劑β-巰基乙醇，后者能打斷多酚氧化酶中的二硫鍵，使多酚不易被氧化，隨后經(jīng)抽提而去除。

    CTAB法流程圖
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