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    學(xué)會(huì)這6步，輕松搞定transwell實(shí)驗(yàn)

    發(fā)布時(shí)間： 2021-11-02　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1959次
    做腫瘤研究的人，很少有不知道 transwell 實(shí)驗(yàn)的，它是用來(lái)研究腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲轉(zhuǎn)移情況的一種簡(jiǎn)便快捷的實(shí)驗(yàn)方法，還可以構(gòu)建兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)體系以及趨化性試驗(yàn)。今天咱們就來(lái)講講怎么做腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。



    Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)，其實(shí)原理簡(jiǎn)單地說(shuō)，就是用一層膜將高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液和低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液隔開，細(xì)胞放在低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液里，為了找吃的，細(xì)胞會(huì)往高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液里面跑，但是有膜擋著，所以要穿過(guò)膜才行。

    我們?cè)谀ど贤可弦粚踊|(zhì)膠，模仿細(xì)胞外基質(zhì)，于是細(xì)胞就要分泌金屬蛋白酶將基質(zhì)消化了才可以從低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液跑到高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液里面，最后我們檢測(cè)高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液里細(xì)胞量就可以知道細(xì)胞的侵襲能力了。而遷移實(shí)驗(yàn)就是不鋪膠直接讓細(xì)胞穿過(guò)就行了。

    圖片
    Transwell 簡(jiǎn)易圖

    以下就來(lái)為大家介紹侵襲實(shí)驗(yàn)步驟：




    實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：transwell 小室（一般選用 12um），24 孔板，基質(zhì)膠（corning），細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所需的基本的材料。

     

    1

        
    基質(zhì)膠鋪板

    用 Matrigel 1：8 稀釋（可以直接用無(wú)血清的培養(yǎng)基稀釋），包被 Transwell 小室底部膜的上室面，置 37℃孵箱 1-4h 使 Matrigel 聚合成凝膠（時(shí)間不宜太長(zhǎng)，之前有人說(shuō)在 37 度孵箱過(guò)夜，反正元元師兄覺(jué)得不太可能）。




    注意事項(xiàng)：




    1. 鋪膠之前將槍頭以及所用的耗材至于冰箱 4 度當(dāng)中，否則配膠的時(shí)候會(huì)直接凝固。
    2. 鋪膠的厚度自己摸索，25ul，40ul，100ul。
    3. 注意鋪膠過(guò)程不要產(chǎn)生氣泡，鋪膠均勻，否則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
    4. 注意無(wú)菌操作。

     

    2

        
    制作細(xì)胞懸液

    1. 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓 12－24h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。
    2. 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，（用 PBS 洗 1－2 遍，這一步很必要，否則細(xì)胞表面覆有血清培養(yǎng)基，細(xì)胞沒(méi)有遷移侵襲的動(dòng)力），用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。

     

    3

        
    接種細(xì)胞

    1. 細(xì)胞懸液 200µl 加入 Transwell 小室（腫瘤細(xì)胞數(shù)目需要摸濃度，從 2 萬(wàn)，5 萬(wàn)，10 萬(wàn)）。
    2. 24 孔板下室一般加入 600µl 含 15%FBS 的培養(yǎng)基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失。在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。
    3. 養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng) 12－48h（主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。24h 較常見，時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。

     

    4

        
    固定染色

    取出 Transwell 小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無(wú)鈣的 PBS 洗 2 遍，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，甲醇或者甲醛固定 30 分鐘，將小室適當(dāng)風(fēng)干。用 0.1% 結(jié)晶紫染色 30-60 min，用 PBS 洗 3 遍。用棉簽輕輕擦掉上室水分。

     

    5

        
    計(jì)數(shù)

    400 倍顯微鏡下隨即五個(gè)視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。




    如果細(xì)胞怎么還是穿不過(guò)去?？偨Y(jié)一下幾個(gè)原因：
    1.  細(xì)胞不具備侵襲轉(zhuǎn)移的能力（例如 MCF7 為非轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞）
    2.  基質(zhì)膠鋪的太厚了 (基質(zhì)膠的稀釋倍數(shù)是可以改的，基質(zhì)膠的量是可以摸的)
    3.  細(xì)胞給的量太少了（200ul 里 2 萬(wàn)細(xì)胞太少，給 5 萬(wàn)，10 萬(wàn)，20 萬(wàn)唄）
    4.  細(xì)胞沒(méi)有進(jìn)行預(yù)處理（這步可以免），也沒(méi)有用 PBS 洗兩遍 (這一步不可省，因?yàn)槟阌靡让赶?，含血清的培養(yǎng)基中和，必須洗干凈了。
    5.  上層的培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基，下室的培養(yǎng)基為 15% 的血清培養(yǎng)基，這個(gè)濃度可以改成 20%，細(xì)胞數(shù)不夠，底下的吸引力也不夠不行哈。
    6.  細(xì)胞的活性太差，半死不活的細(xì)胞做侵襲實(shí)驗(yàn)傷不起哈。



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