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    從組織培養(yǎng)細胞中制備粗微體的方法

    發(fā)布時間： 2021-11-17　　點擊次數(shù)： 967次

    材料與儀器

    細胞
    環(huán)己酰亞胺 勻漿緩沖液
    培養(yǎng)皿

    步驟

    1. 培養(yǎng)基中加入環(huán)己酰亞胺（溶于蒸餾水，貯存液濃度 0.1 mol/L，-20℃ 保存。如果不溶，試著加熱到 40℃ 以幫助溶解）（終濃度 10 μmol/L)，37℃ 保溫 5~10 分鐘。

    2. 培養(yǎng)皿從 37℃ 轉(zhuǎn)移到冷室，立即去掉培養(yǎng)基，用含有與培養(yǎng)基同樣環(huán)己酰亞胺濃度的冰冷 PBS 洗滌細胞 3 次，將培養(yǎng)皿口朝下倒立于紙巾上數(shù)分鐘，偶爾拍打。用 Kimwipe 紙巾擦掉側(cè)壁上殘留的 PBS。

    3. 加入 0.7 ml 含有 2~4 單位/ml RNase-IN (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) 的 HM，輕輕混旋培養(yǎng)皿以使 HM，能夠覆蓋培養(yǎng)皿的底面。

    勻漿緩沖液（HM）：

    10 mmol/L HEPES-KOH 緩沖液，pH 7.5

    10 mmol/L KCl

    1 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L DTT

    0.5 mmol/L PMSF

    4. 將培養(yǎng)皿取一定的角度，在 HM 中打濕橡皮或塑料淀帚，按同一方向?qū)⒓毎麖呐囵B(yǎng)皿的一邊刮到另一邊。

    5. 將刮取的細胞懸浮于 HM 中并集中到培養(yǎng)皿的一邊，打濕細胞淀帚以同樣的方法刮取培養(yǎng)皿其他部分的細胞，直到整個培養(yǎng)皿的細胞刮完（細胞刮走后培養(yǎng)皿的表面變得光滑)。用新鮮 HM 將玻璃吸管內(nèi)表面打濕（見第 4 步），將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到一個小的緊密配套的 Dounce 勻漿器中（Kontes)。

    6. 加 0.7 ml 新鮮 HM 到細胞已被刮掉的培養(yǎng)皿中，用細胞淀帚刮洗培養(yǎng)皿底部，將洗滌液轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)皿中，用同樣的方法刮取細胞，將細胞懸浮液集中到 Dounce 勻漿器中。

    7. 當(dāng)兩到三個培養(yǎng)皿中的細胞懸浮液集中到一起以后，照下面的方法勻漿：

    (1) 以微小的角度握住 Dounce 勻漿器的管子立在桌子上。

    (2) 慢慢將玻璃研杵插入，直到研杵的頭部與細胞懸浮液表面接觸，沿管子的一邊用力將研杵上下推動。

    (3) 重復(fù)步驟 (2)，一上一下為一次共進行 15~20 次杵擊。

    8. 細胞勻漿后立即用玻璃吸管將勻漿物轉(zhuǎn)移到一個試管中，并與 1/10 體積的 2.5 mol/L 蔗糖混合。

    9. 重復(fù) 3~ 8 步，直到所有培養(yǎng)皿中的細胞被勻漿。

    10. 測量勻漿物的體積。

    11. 在 Sorvall HB-4 轉(zhuǎn)頭（700 g ) 中 2100 r/min 離心 3 分鐘，增加速度到 6500 r/min（7000 g)，再離心 10 分鐘。

    12. 轉(zhuǎn)移上清（PMS）到一個刻度量筒中并加 0.9 體積的 2.5 mol/L 蔗糖以得到終濃度力 1.33 mol/L 的蔗糖-PMS 混合液，或者加 2.2 體積的 2.5 mol/L 蔗糖以得到終濃度為 1.8 mol/L 的蔗糖-PMS 混合液。

    13. 在 SW41 轉(zhuǎn)頭離心管中準(zhǔn)備下列分級梯度（從下到上）：

    梯度 a：

    1.5 ml 1.8 mol/L 的蔗糖-HM

    1.5 ml 含 2~4 單位/ml RNase-IN 的 1.5 moI/L 蔗糖-HM

    5 ml 蔗糖-PMS 混合物

    1.5 ml 1.0 mol/L 的蔗糖-HM

    1.5 ml 0.6 mol/L 的蔗糖-HM

    1 ml 0.25 mol/L 的蔗糖-HM

    梯度 b：

    5 ml 蔗糖-PMS 混合物

    1.5 ml 含 2~4 單位/ml RNase-IN 的 1.5 mol/L 蔗糖-HM

    1.5 ml 含 2~4 單位/ml RNase-IN 的 1.3 mol/L 蔗糖-HM

    1.5 ml 1.0 mol/L 的蔗糖-HM

    1.5 ml 0.6 mol/L 的蔗糖-HM

    1 ml 0.25 mol/L 的蔗糖-HM

    14. 在 SW41 轉(zhuǎn)頭中 4℃ 41000 r/min ( 最大 286500 g ) 離心 16 小時（梯度a ) 或離心至少 5 小時（梯度b）。

    15. 收集在 1.5 mol/L 和 1.8 mol/L 蔗糖層交界面形成的物質(zhì)，這被認為是重粗微體部分。

    16. 根據(jù)實驗?zāi)康挠孟铝蟹椒ㄖ械囊环N濃縮微體

    (1) 為了獲得好的多聚核糖體分離圖譜

    ① 用 0.1% SDS 溶液 100 倍稀釋一部分微體，測量 260 nm 和 280 nm 的吸收值。

    ② 估計 100 μl 微體是否含有足夠多的核糖體來展示多聚核糖體在蔗糖密度梯度中的分布圖。

    ③ 用 HM 5 倍稀釋樣品或 7 倍稀釋樣品，并用 SW41 轉(zhuǎn)頭在蔗糖線性密度梯度中進行分析。

    (2) 為了收集沉淀

    ① 用 HM 3 倍稀釋樣品或 5 倍稀釋樣品。

    ② 根據(jù)樣品的體積在 Beckman Ti60 或 Ti50 轉(zhuǎn)頭中 40000 r/min ( 最大 160000 g) 離心 60~80 分鐘。

    (3) 為了用于體外翻譯和重建實驗

    ① 用含 RNase 抑制劑的 HM 3 倍稀釋樣品或 5 倍稀釋樣品。

    ② 將稀釋的樣品加到 1.8 mol/L 蔗糖墊層溶液上，在 SW41 或 SW60 轉(zhuǎn)頭（轉(zhuǎn)頭的選擇取決于樣品的體積）中 35000 r/min ( 最大 210000 g）離心 60 分鐘。

    ③ 收集在墊層溶液上部形成的微體膜條帶，如果有必要用 SW60 轉(zhuǎn)頭進一步濃縮到較小的體積中。


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