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    備擇方案 1 對貼壁細胞

    發(fā)布時間： 2022-03-10　　點擊次數(shù)： 861次

    原理

    材料與儀器

    貼壁細胞 [35S]標記L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]標記蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物
    PBS(冷凍) 37℃ 脈沖標記培養(yǎng)基
    100 mm 組織培養(yǎng)皿 配有液體同位素垃圾閥門的真空吸氣器

    步驟

    1. 在 100 mm 組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 細胞，取決于細胞類型）。


    2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體（見基本方案步驟 1）。


    3. 吸棄上清并用 10 ml 預熱（37℃）脈沖標記培養(yǎng)基輕柔洗細胞 2 次，棄掉洗液。


    4. 加 5 ml 預熱脈沖標記培養(yǎng)基，在潮濕、37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 15 min，以除去細胞內(nèi)的甲硫氨酸。


    5. 棄掉細胞上的培養(yǎng)基，加入 2 ml [35S] 甲硫氨酸的工作液體（見步驟 2），在 CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 10~30 min。


    6. 棄掉細胞上的培養(yǎng)基。用 10 ml 冷凍的 PBS 洗細胞并棄掉 PBS。加 10 ml 冷凍的 PBS，并用塑料刮子或橡膠細胞刮小心刮取收集細胞。


    7. 轉(zhuǎn)移懸液到 15 ml 離心管中，4℃，300 g 離心 5 min，棄上清。如果在標記過程中細胞明顯脫落，有必要將含有 [35S] 甲硫氨酸的工作液中的細胞小心刮取，并將懸液轉(zhuǎn)移到 15 ml 離心管中，在用 PBS 洗滌前離心。


    8. 可選：通過 TCA 沉淀法測定標記摻入的量（見輔助方案）。

    注意事項

    如果在標記過程中細胞明顯脫落，有必要將含有[35S]甲硫氨酸的工作液中的細胞小心刮取， 并將懸液轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中，在用PBS洗滌前離心。

    常見問題

    １. 實驗材料中貼壁細胞，如 HeLa、NRK、Ml、COS - 1、CV - 1，或原代培養(yǎng)的成纖維細胞或內(nèi)皮細胞。

    ２. 如果細胞沉淀不馬上使用的話，見基本方案步驟7。

    同實驗其他方法

    氨基酸代謝標記實驗

    1. 室溫融化 [35S] 標記甲硫氨酸，并用預熱的（37℃）脈沖標記培養(yǎng)基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室溫下 300 g 離心 5 min，獲得懸液中 0.5 × 107~

    備擇方案 2 示蹤標記細胞

    1. 每個時間點和每個樣品準備 0.5 × 107 ~2 × 107 細胞， 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 細胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脈沖標記

    備擇方案 3 長期細胞標記

    1. 在預熱的 37℃ 長期標記培養(yǎng)基中制備 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液（見基本方案步驟 1）。2.1 對于懸浮細胞：用預熱的長期標記培養(yǎng)基準備并洗細胞一次

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