步驟

實驗所需「試劑」具體見「其他」

1. 引物設計

PK-120 部分分解多肽氨基酸序列中，最長序列 K-15，16 為引物設計的依據(jù)：

1.1 考慮全部編碼的組合，

1.2 考慮人編碼的使用頻率，設計 PCR 引物，正義鏈及反義鏈如用這些引物獲得的 PCR 產(chǎn)物當中，50 bp 的產(chǎn)物為目的 cDNA。

2. PCR 擴增

從肝臟來源的 poly（A）+ RNA 中，用 Gene Amp RNA PCR 試劑盒如以下所述，合成 cDNA 0.1ug 的 poly（A）+ RNA 中，加入 5 mmol/L MgCl2：

1×PCR 緩沖液Ⅱ，

2 mmol/L dNTPs，

1u 的 RNase inhibitor，

2.5 umol/L random hexamers

2.5 u 反轉錄酶，

混勻，總體積為 20 ul。

在 PCR 擴增儀上反應，PCR 參數(shù)為 ：

25℃ 10 min，

42℃ 30 min，

99℃ 5 min，

25℃ 5 min ，

第 1 循環(huán)反應，合成 cDNA。

在反應液中再分別加終濃度為 2 mol/L MgCl2，1×PCR 緩沖液Ⅱ，加 1nmol 3' 引物 5' 引物?；旌?，總體積為 100 ul。

94℃ 3 min 1 循環(huán)。

94℃ 1 min，

37℃～42℃，2 min，

72℃， 2 min，

40 循環(huán)。

72℃， 7 min，1 循環(huán)。

3. 凝膠電泳及提取 DNA

純化 PCR 產(chǎn)物后，在 0.25×TBE 溶液中，進行 10％ 聚丙烯酰胺凝膠電泳，分子量標準使用限制性酶 Msp1 消化的質粒 pBR322。電泳結束后，凝膠經(jīng)溴化乙錠染色，紫外照射，觀察到 50 bp 的 PCR 產(chǎn)物。將這 50 bp 的條帶切下，在抽提液中，室溫放置過夜之后 1200 r/min 4℃ 離心 10 min，回收上清。反復操作兩次，用乙醇沉淀 2 次，用 TE 液溶解，上樣 Sephadex-50 柱，再用乙醇沉淀洗脫組分，沉淀懸浮于 TE 溶液中。

4. 測定堿基序列

抽取提出的 PCR 產(chǎn)物用 PCRⅡ載體亞克隆，測定堿基序列。其結果以肝臟 poly mRNA 為模板，據(jù)引物 S15-i 和 A15-i 擴增的 50 bp 的 PCR 產(chǎn)物序列，和從氨基酸序列預測的堿基序列*一致。表明這是編碼母的部分分解多肽的 cDNA。

注意事項

常見問題

試劑：

Sephadex-50

Gene Amp RNA PCR 試劑盒

合成寡聚核苷酸用 BIO-SYNTHESIS，INC 公司產(chǎn)品合成寡聚核苷酸

抽提液

750 mmol/L 醋酸銨-10 mmol/L 醋酸鎂-0.1 mmol/L EDTA-0.1％SDS-1％TE 飽和酚

25ug/ml 酵母 tRNA