簡介

在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，必須有可以貼附的支持物表面，其依靠自身分泌或培養(yǎng)基中的貼附因子才能在該表面生長增殖的離體動物的培養(yǎng)細(xì)胞。

由于血清具有終止胰蛋白酶消化，提供細(xì)胞生長所需的貼壁因子、免疫球蛋白、胰島素等其它營養(yǎng)成分及細(xì)胞因子，因此成為體外細(xì)胞培養(yǎng)液中的常用添加成分，其對細(xì)胞的培養(yǎng)意義重大。

原理

細(xì)胞在人工基質(zhì)上單層生長（貼壁培養(yǎng)）
貼壁細(xì)胞分類：皮細(xì)胞型，成纖維細(xì)胞型，游走細(xì)胞型和多型細(xì)胞型。

在顯微鏡下觀察時，貼壁細(xì)胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不規(guī)則的三角形或扇形或其它形態(tài)，而且晃動培養(yǎng)液時，細(xì)胞不動。

培養(yǎng)細(xì)胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當(dāng)與底物貼附后，細(xì)胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)，呈成纖維細(xì)胞樣或上皮細(xì)胞樣等。

材料與儀器

【材料與試劑】細(xì)胞、PBS 或 DPBS、0.25% (w/v) Trypsin-EDTA、75% 乙醇、培養(yǎng)基（以DMEM為例）、100X 雙抗（鏈霉素-青霉素）、胎牛血清、細(xì)胞凍存液。

【實驗儀器與耗材】培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶、移液槍、離心管、記號筆、封口膜、凍存管、程序降溫凍存盒、液氮罐、離心機(jī)、37℃ 恒溫培養(yǎng)箱（5% 二氧化碳濃度）、倒置相差顯微鏡、冰箱、無菌細(xì)胞操作臺。

步驟

一、試劑準(zhǔn)備
DMEM*培養(yǎng)基（10% 胎牛血清）：44.5 mL DMEM +5 mL 胎牛血清+500 μL 100X 雙抗，搖勻，4 ℃ 冷藏保存，使用前于 37 ℃ 恒溫水浴鍋中預(yù)熱 15 分鐘。

PBS、*培養(yǎng)基、根據(jù)細(xì)胞特性選擇合適的解離液（例如Gibco? TrypLE? Express、胰蛋白酶）或機(jī)械吹打消化細(xì)胞、胰蛋白酶解離劑 0.25%  (w/v) Trypsin-EDTA 4℃ 冷藏保存，使用前于37 ℃ 恒溫水浴中鍋預(yù)熱 15 分鐘。

二、 細(xì)胞復(fù)蘇
1. 超凈工作臺使用前紫外線照射 30 分鐘。使用前，后用 75% 酒精擦拭臺面。保持臺面干凈整潔。使用時一定打開通風(fēng)。

2. 將凍存細(xì)胞從-80 度冰箱或液氮罐中取出，立即放入（2分鐘內(nèi)）37 ℃ 恒溫水浴中預(yù)熱水浴鍋中（或在手心中反復(fù)摩擦），不停晃動以化凍。

3. 立刻將化凍的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移進(jìn)裝有 3 mL DMEM*培養(yǎng)基的 5 mL離心管中并吸打均勻。注意液體不要留在瓶口或瓶蓋上，避免增加污染的可能。

4. 復(fù)蘇細(xì)胞時，離心機(jī)提前降溫至4℃，以 1000 rpm 的轉(zhuǎn)速將細(xì)胞懸液離心 5 分鐘并棄上清（離心的速度和時間根據(jù)細(xì)胞系的不同有所差異）。

5. 用 3 mL DMEM*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移進(jìn) 6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

6. 在顯微鏡下觀察復(fù)蘇細(xì)胞的狀態(tài)（是否為單個細(xì)胞懸液，有無成團(tuán)，活細(xì)胞的比例），并及時（每48小時）更換DMEM*培養(yǎng)基。

7. 當(dāng)細(xì)胞密度占顯微鏡視野 80%-90% 時，應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

三、貼壁細(xì)胞傳代（以 6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿為例）
1. 棄置原培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，從培養(yǎng)皿邊緣加入 2 mL 預(yù)熱的PBS平衡鹽溶液潤洗細(xì)胞（注意不要直接沖到細(xì)胞表面），并棄置。

2. 沿培養(yǎng)基側(cè)壁加入1 mL預(yù)熱的 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA，使胰蛋白酶*覆蓋細(xì)胞表面。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 2 min（孵育時間根據(jù)細(xì)胞系不同有所差異，如不確定細(xì)胞消化時間，每隔 1min 取出在顯微鏡下觀察，約有 50-70% 細(xì)胞飄起，即可繼續(xù)操作）。

3. 向培養(yǎng)皿中加入1 mL *培養(yǎng)基中和Trypsin的作用，并輕輕吸打細(xì)胞表層數(shù)次。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到 5 mL 離心管中，在室溫下以 1000 rpm 的轉(zhuǎn)速將細(xì)胞懸液離心 3 分鐘。

4. 小心棄去離心管中的上清液，使用 1mL *培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞沉淀，使其*被吹打為單個細(xì)胞狀態(tài)，盡量減少泡沫的產(chǎn)生。

5. 進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后以 1:3（1:3～1:6均可）的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。

6. 取三只新 6 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，每只培養(yǎng)皿中加入 3 mL *培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液平均分配至三只培養(yǎng)皿中，蓋上蓋子后，按照畫“十字"的操作，將細(xì)胞搖勻。

7. 細(xì)胞培養(yǎng)皿放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)并及時更換培養(yǎng)液。

四、貼壁細(xì)胞凍存：
1、細(xì)胞處于生長對數(shù)期且狀態(tài)良好時，收集細(xì)胞以便凍存；

2、制備冷凍培養(yǎng)液（含DMSO），在 4°C 下保存。注：合適的冷凍培養(yǎng)基取決于細(xì)胞系種類。

3、按照貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程中用的操作，將細(xì)胞解離下來；

4、600 g, 4℃ 離心 5 min 收集細(xì)胞，然后棄掉上清，從冰箱取出細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，分裝至凍存管中；

5、將凍存管移入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入 -80℃ 冰箱，過夜，第二天移至液氮罐中。

注意事項

1、嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，每次拿取東西時應(yīng)使用75%乙醇噴灑表面進(jìn)行充分消毒；

2、細(xì)胞培養(yǎng)皿上應(yīng)清楚標(biāo)記：操作人、時間、細(xì)胞系；

3、化凍細(xì)胞速度應(yīng)快，盡量在 5 min 內(nèi)完成操作；

4、離心管放入離心機(jī)前應(yīng)用封口膜纏繞；

5、超凈臺使用前應(yīng)用紫外照射 30 min 以上；

6、所有與細(xì)胞直接接觸的材料和儀器均應(yīng)處于無菌狀態(tài)

7、如果使用培養(yǎng)瓶，在將其放回培養(yǎng)箱之前，若使用的培養(yǎng)瓶的瓶蓋不帶透氣孔，則需旋松瓶蓋，以便進(jìn)行適當(dāng)?shù)臍怏w交換；

8、如果細(xì)胞培養(yǎng)基已冷藏（2-8°C），使用前在 37℃ 水浴鍋預(yù)熱；

9、細(xì)胞培養(yǎng)基保持避光儲存；

10、細(xì)胞培養(yǎng)基添加 FBS 后，將*培養(yǎng)基放入冰箱（2-8°C）以保持性能。并在 2-4 周內(nèi)使用含添加劑的培養(yǎng)基，以減少污染機(jī)率和 pH 值變化的影響；

常見問題

1. 所有與細(xì)胞直接接觸的材料和儀器均應(yīng)處于無菌狀態(tài)。

2. 如遇Trypsin 消化不佳的細(xì)胞（如RAW264.7細(xì)胞），可以采取使用無菌的細(xì)胞刮刀輕柔的將細(xì)胞刮下再處理。

3. DMSO 具有細(xì)胞毒性，復(fù)蘇細(xì)胞的過程操作要迅速，并用 3 倍體積以上的*培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。

4. 細(xì)胞復(fù)蘇后應(yīng)在 12～24 h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)。如遇到細(xì)胞污染，應(yīng)立即丟棄細(xì)胞，并對環(huán)境進(jìn)行消毒。

5. 凍存細(xì)胞應(yīng)選擇傳代次數(shù)較少的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞傳代高于15 代后，細(xì)胞應(yīng)丟棄，復(fù)蘇新的細(xì)胞再進(jìn)行試驗。

6. 復(fù)蘇后的細(xì)胞不能立即進(jìn)行試驗，需傳代 2-3 代，待細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后，才可進(jìn)行相關(guān)試驗。復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳，可考慮重新復(fù)蘇；

若重新復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)仍舊不佳，可考慮適當(dāng)提高胎牛血清的比例（從10%提升至15%，最大提升至20%），待細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)后再使用平時使用的培養(yǎng)基。

7. 如想收獲到更多數(shù)量的細(xì)胞，可以將 6 cm皿細(xì)胞懸液接種于10 cm皿中，并增大*培養(yǎng)基的使用量。

8、復(fù)蘇細(xì)胞后細(xì)胞狀態(tài)差：1）首先，凍存細(xì)胞時選擇處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細(xì)胞；2）復(fù)蘇時，水浴鍋提前預(yù)熱至37℃，離心機(jī)提前降溫至 4℃；

9、細(xì)胞交叉污染：1）培養(yǎng)細(xì)胞系時盡量不要多種細(xì)胞系同時培養(yǎng)；2）不同細(xì)胞系培養(yǎng)基單獨配置，盡量不要交叉使用；3）注意操作規(guī)范；