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    放射自顯影術(shù)實驗

    發(fā)布時間： 2022-12-06　　點擊次數(shù)： 1085次

    簡介


    培養(yǎng)細胞的放射自顯影術(shù)射性既可以研究細胞本身的物質(zhì)代謝之外，還可用來分析細胞的動態(tài)活動、細胞周期等。


    原理


    培養(yǎng)細胞放射自顯影術(shù)原理是將培養(yǎng)細胞的放射性同位素釋放射線，作用于感光乳膠，使感光乳膠中的鹵化銀感光形成潛影，再經(jīng)顯影劑作用，感光的鹵化銀還原成黑色的銀顆粒，未感光的銀鹽則經(jīng)定影去除，在乳膠中留下清楚明確的圖像。 


    材料與儀器


    器材：
    ① 培養(yǎng)的細胞
    ② 細胞傳代培養(yǎng)的設(shè)備
    ③ 直徑 3.5 cm 塑料培養(yǎng)皿（或 50 ml 培養(yǎng)瓶）
    ④ 2.2 cm x 2.2 cm 蓋片（或自裁成 6 mm x 40 mm，放入培養(yǎng)瓶）
    ⑤ 曝光鉛盒或黑色塑料盒
    ⑥ 電磁攪拌器
    ⑦ 恒溫臺（可調(diào)節(jié)溫度以烘干乳膠）
    ⑧ 載片
    ⑨ 中性樹膠
    ⑩ 暗室及相應(yīng)設(shè)備
    試劑：
    ① 同位素標記物（如 3 H-TdR、3 H-UdR 等）
    ② 液體乳膠（常用核 IN 號）
    ③ 顯影液
    ④ 定影液
    ⑤ 甲醇
    ⑥ 吉姆薩染液


    步驟


    培養(yǎng)細胞放射自顯影術(shù)的基本過程可分為以下幾步:
    （1）同位素標記物與細胞的結(jié)合
    A. 用培養(yǎng)基稀釋同位素標記物，培養(yǎng)細胞放射自顯術(shù)常用濃度為 0.1～2 μ Ci/ml。如采用 3 H-TdR，建議濃度為 0.5～1 μ Ci/ml。
    B. 棄去培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基，用 Hanks 緩沖液洗涮 1 次，加入上述含有同位素的培養(yǎng)基。一般 50 ml 培養(yǎng)瓶加 3 ml 培養(yǎng)液。
    C. 將上述細胞置 37 ℃ 恒溫箱溫育一定時期（溫育時間按實驗要求和同位素種類及濃度等因素而定，一般如 3 H-TdR 在 1 μ Ci/ml 濃度下，溫育 1～4 h 即可），然后棄去培養(yǎng)液，用 Hanks 液涮洗 3 次，以去除未摻入細胞內(nèi)的放射性物質(zhì)。
    （2）固定
    按常規(guī)細胞學(xué)方法進行，但應(yīng)避免使用含有重金屬離子的固定液，以免增加本底顆粒數(shù)目。建議用純甲醇固定，時間 30 min 以上。
    （3）涂布乳膠
    A. 乳膠的準備于暗室中紅光下，將核 IN 乳膠從不透光的容器中取出，置于 10 ml 小燒杯中，將小燒杯置于電磁攪拌器上，放入潔凈鐵芯小玻棒 1 枚，開啟電磁攪拌器，使乳膠化，為稀釋起見，可加入適量附加液或三蒸水，攪拌數(shù)分鐘使乳膠與附加液充分混合均勻。如無電磁攪拌器，可將三蒸水 40 ℃ 預(yù)熱，然后加入等量或 2/3 量的核 IN 乳膠，用干凈玻棒攪拌均勻，應(yīng)避免出氣泡。
    B. 將生長有培養(yǎng)細胞的小蓋片條（或培養(yǎng)皿中的方蓋片）取出，將其一端用膠布粘于載片上（注意：使有細胞的一面朝上，此面外觀較粗糙），然后在有細胞的蓋片上滴 1 滴乳膠，用吸管將乳膠輕輕涂開。
    C. 將上述涂有乳膠的玻片直立于切片架上，使乳膠盡量成為薄層，再以低速小風(fēng)扇吹干。
    D. 待乳膠干硬后（10～20 min），將片子置于預(yù)先置有干燥劑（常用硅膠或氯化鈣）的曝光盒內(nèi)，用黑紙將曝光盒包嚴，注明同位素標本記號，置 4 ℃ 冰箱內(nèi)，或室溫下曝光。
    （4）曝光
    曝光時間隨標本的放射性強度、同位素劑量和實驗要求而定。為闡明同位素在細胞和組織內(nèi)的精確定位，曝光時間要短；為了顯示小量放射性同位素的定位，曝光時間宜長。對半衰期長的同位素，活性小的標本應(yīng)相應(yīng)地增加曝光時間。為選擇最佳曝光時間，可參考同類的工作，一般應(yīng)進行試驗性曝光，以決定最佳曝光時間。3 H、C、35 S 標記物通常曝光 3～7 d 即可。
    （5）顯影與定影
    顯影與定影時間隨曝光時間和同位素劑量而不同，在一般照相的顯影液中，于 18～20 ℃ 時，顯影 3～5 min，然后在 1% 乙酸溶液中置 1～3 min，再轉(zhuǎn)入定影液內(nèi) 30 min 左右。
    （6）染色
    將標本用自來水連續(xù)沖洗數(shù)分鐘（切忌水流過急、過大），再以三蒸水洗涮 1 次，晾干后用吉姆薩染色（也可用 HE 染色）。
    （7）封片
    染色后晾干，用中性樹膠封片，在油鏡下觀察、攝影。


    注意事項


    1. 涂布乳膠有各種方法，其原則是涂布要均勻一致，此外盡可能地要稀薄。
    2. 從涂布乳膠開始須在暗室內(nèi)進行，直至定影完畢方可見光。
    3. 同位素廢棄物處理須嚴格按要求執(zhí)行，不可污染環(huán)境。


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