材料與儀器

D-PBSA 無血清角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)液 胰蛋白酶 EDTA Biocoat6孔培養(yǎng)板

步驟

一、材料

滅菌

無血清角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)液（keratinocyteserum-freemedium，KGM;Clonetics): 含有 0.15 mmol/LCa2-、0.1ng/ml 人上皮生長因子、5ug/ml 胰島素、0.5ug/ml 氫化可-的松和 30ug/ml 牛垂體提取物。

EMEM(Eagle'sminimalessentialmedium)

D-PBSA：不含 Ca2+和 Mg2+的 DulbeccoPBSA 液 FBS

胰蛋白酶和 EDTA 混合液：0.05% 胰蛋白酶，0.5 mmol/L EDTA
纖連蛋白和膠原蛋白混合液（fibronectin/collagen，F(xiàn)NC)：10ug/ml 纖連蛋白、35ug/ml 膠原蛋白和 lOOug/mlBSA。BSA 作為穩(wěn)定劑

Biocoat 6 孔培養(yǎng)板：涂有鼠尾 I 型膠原蛋白（B-D Biosciences)

二、操作步驟 

原代培養(yǎng) 

1. 將供體角膜放于消毒過的物品上，上皮面朝上，用手術(shù)刀切成 12 個三角形組織片。應(yīng)一刀切下去，避免鋸割。如此仔細處理角膜可減少對膠原蛋白基質(zhì)的破壞和成纖維細胞的脫落。

2. 將角膜組織片的上皮面翻向下，放入用鼠尾 I 型膠原蛋白預(yù)涂的 6 孔培養(yǎng)板，每孔放 4 個組織塊。

3. 用鑷子輕壓組織片，以便使組織塊與培養(yǎng)皿表面充分接觸。將組織片放置 20 min，使其變干。

4. 將一滴 KGM 輕輕滴于組織片上，在 37°C 和 5%CO2 條件下孵育過夜。盡管從眼庫得到的供體角膜是用含有抗菌素的培養(yǎng)液（McCarey-Kauffman 或 Dexsol) 保存的，但全部操作應(yīng)在無菌條件下進行。

5. 第 2 天，在培養(yǎng)皿中加人 lml 培養(yǎng)液。在培養(yǎng)早期，可觀察到細胞僅從角膜緣處遷出，但沒有細胞從角膜中央部或鞏膜遷出。無血清培養(yǎng)液含有低濃度鈣（0.15 mmol/L)，減少膠原蛋白基質(zhì)降解，故這種培養(yǎng)液可減少成纖維細胞長出。

6 在植入角膜組織片后第 5 天，用鑷子將組織片取出，再加人 3 ml 培養(yǎng)液。取出組織片后，貼壁細胞繼續(xù)增殖。培養(yǎng)后第 2 周，細胞生長形成單層，呈現(xiàn)上皮具有的典型卵石狀排列特征。每個角膜約獲得 1X106?5X106 個上皮細胞。

擴增培養(yǎng)

7. 取出組織片后，每周換液 2 次。

8 當(dāng)細胞匯合達 70%?80% 時，用 D-PBSA 浸洗細胞。然后，在 37°C 條件下用胰蛋白酶和 EDTA 混合液處理 4 min。

9. 用含有 10% FBS 的 D-PBSA 終止消化。

10 將細胞離心后，用 KGM 混懸。計數(shù)細胞，以 1X104 個/cm2 密度將細胞接種于涂有 FNC 的培養(yǎng)皿。

11 在 37°C、95% 空氣和 5%CO2 條件下培養(yǎng)。

12. 胰蛋白酶處理和種植 1d 后換培養(yǎng)液。

傳代后不久，上皮細胞呈長梭形，折光，遷移能力較強。傳代后第 1 周，細胞匯合達 70%?80% 時呈卵石狀排列。如果形成單層后繼續(xù)培養(yǎng)，細胞能生長成散在的復(fù)層結(jié)構(gòu)。

盡管角膜上皮細胞能傳至 5 代，約倍增 9?10 倍，但大多數(shù)細胞增殖發(fā)生在第 1?3 代。每個角膜約獲得 1X106?2X106 個上皮細胞。細胞常在第 5 代開始衰老。