步驟

一、原代培養(yǎng)

1. 取手術(shù)切除或早期活檢組織，將組織放入轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)液（Leibowitz L-15培養(yǎng)液，添加 100 μg/ml 慶大霉素、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素和 1μg/ml     2性霉素B），盡快送到實(shí)驗(yàn)室。

2. 將組織移入 100 mm 培養(yǎng)皿，用 P-PBSA （不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Dulbecco PBSA）浸洗。

3. 盡量切除結(jié)締組織和有血液部分。如果組織標(biāo)本的表面面積 ≥1 cm2，將其切成小塊。

4. 將組織塊放入 35 mm 培養(yǎng)皿，然后加入足夠 0.17 % 胰蛋白酶液（用 P-PBSA 配制），覆蓋組織塊。在 4°C 條件下孵育過(guò)夜。

5. 用一把鑷固定組織塊，用另一把鑷將上皮剝離入胰蛋白酶液。

6. 將組織懸液輕輕研磨幾次，使細(xì)胞進(jìn)一步分散。然后，將細(xì)胞懸液移入離心管。

7. 用 D-PBSA 浸洗培養(yǎng)皿，然后將浸洗液加入細(xì)胞懸液。浸洗用量同步驟 4 組織消化的胰蛋白酶液。

8. 用微吸管吸取一等份測(cè)定細(xì)胞產(chǎn)量。

9. 在4°C 條件下離心（125 g），最好用制冷離心機(jī)。用生長(zhǎng)培養(yǎng)液混懸細(xì)胞。

10. 按要求用含抗菌索的生長(zhǎng)培養(yǎng)液（生長(zhǎng)培養(yǎng)液添加 100 μg/ml 慶大霉素、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素和 1 μg/ml   2性霉素B）稀釋細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞接種于涂有 FN/C/BSA 的 50 mm 培養(yǎng)皿，密度為 5×103 個(gè)/cm2。

11. 24 h 后換培養(yǎng)液，以除去細(xì)胞碎片和紅細(xì)胞。

12. 隔天換液。

二、傳代培養(yǎng)

13. 用 D-PBSA 浸洗細(xì)胞。

14. 加入 PET 液（含有 1 % 聚乙烯吡咯酮（PVP，40 KDa）、0.5 mmol/L EGTA 和 0.025 % 胰蛋白酶，用 D-PBSA 配制），完-全覆蓋細(xì)胞，如在 100 mm 培養(yǎng)皿加入3 ml。

15. 在室溫下孵育，直至細(xì)胞變圓或從培養(yǎng)皿去附著。在顯微鏡下觀察細(xì)胞去附著情況，此過(guò)程一般需要 1.5 min?？赏ㄟ^(guò)加入高濃度胰蛋白酶或在 37°C 條件下消化提高去附著效率。

16. 當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞去附著時(shí)，輕彈培養(yǎng)皿和用胰蛋白酶液吹打細(xì)胞，以機(jī)械性地加強(qiáng)去附著。

17. 細(xì)胞去附著后，向培養(yǎng)皿加入 5~10 ml D-PBSA，終止胰蛋白酶的消化。

18. 將細(xì)胞懸液注入離心管，輕輕研磨，以使細(xì)胞充分混懸。

19. 用 1 ml 吸管取細(xì)胞懸液，加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)細(xì)胞。

20. 計(jì)算懸液中細(xì)胞密度。

21. 在 4°C 條件下離心（125 g，5 min）。

22. 吸去上清液，用手指輕彈離心管，直至沉下的細(xì)胞分散。

23. 加入適量生長(zhǎng)培養(yǎng)液，用吸管輕輕混懸細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液注入培養(yǎng)皿。

24. 將全部培養(yǎng)皿放入淺盤內(nèi)，用手移動(dòng)淺盤，并變化移動(dòng)方向，從而搖動(dòng)培養(yǎng)皿。注意保證每個(gè)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞密度均勻，即搖動(dòng)培養(yǎng)皿時(shí)集中于培養(yǎng)皿中心。另外，應(yīng)注意將放培養(yǎng)皿的架平坦固定于孵育箱，孵育箱不能振動(dòng)，以免細(xì)胞在貼壁過(guò)程中分布不均勻。

25. 將細(xì)胞靜置孵育 4~24 h，然后換培養(yǎng)液。