材料與儀器

肝素或枸櫞酸抗凝的血液樣本 D-PBSA Ficoll-Hypaque
無(wú)血清培養(yǎng)液
帶有鈍頭插管的注射器 塑料Pasteur吸管或移液器 血細(xì)胞計(jì)數(shù)器或電子細(xì)胞計(jì)數(shù)器 離心機(jī)

步驟

1. 用枸櫞酸或肝素抗凝容器采集血液標(biāo)本（肝素或枸櫞酸抗凝的血液樣本，枸櫞酸或肝素的濃度依收集容器而定。透明的離心管或普通容器），然后送到實(shí)驗(yàn)室。

2. 用 D-PBSA 按 1：1 稀釋后，將 9 ml 血液加在 6 ml Ficoll-Hypaque （將比重調(diào)整為 1.077 g/cc）上。使用帶蓋的粗大透明離心管如 25 ml Sterilin 或 Nimc 普通容器，或在 50 ml 透明的塑料 Corning 離心管中加入雙倍的液量。

3. 離心（400 g，15 min），這是在界面中心測(cè)量的離心速率。

4. 不要攪動(dòng)界面，小心地吸出血漿和 D-PBSA 層。

5. 帶有鈍頭插管的注射器或塑料巴斯德吸管收集含有淋巴細(xì)胞的液層，然后用無(wú)血清培養(yǎng)液如 RPMI 1640 將其稀釋至 20 ml。

6. 將稀釋的細(xì)胞懸液離心（70 g，10 min）。

7. 棄去上淸液，用 2 ml 無(wú)血清培養(yǎng)液混懸沉降細(xì)胞。如果需要洗幾次（如除去血清因子），可再用 20 ml 無(wú)血清培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，離心 2 次或 3 次。最后，用 2 ml 無(wú)血清培養(yǎng)液混懸沉淀細(xì)胞。

8. 取一份細(xì)胞樣本，用美藍(lán)染色，然后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)有核細(xì)胞。取另一份細(xì)胞樣本，用 Zapoglobin (Beckman Coulter) 溶解，利用 70~100 μm 口徑的管在電子細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)細(xì)胞核。

淋巴細(xì)胞與一些血小板和單核細(xì)胞集中于一層。雖然在步驟 3 離心的大部分粒細(xì)胞主要見于 Ficoll-Hypaque 中，但有些粒細(xì)胞可位于淋巴細(xì)胞層。通過利用單核細(xì)胞和粒細(xì)胞附著玻璃（微珠或培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)表面）或尼龍網(wǎng)的特點(diǎn)，能將單核細(xì)胞和殘留的粒細(xì)胞從淋巴細(xì)胞層中除去。如果需要分離更純的細(xì)胞，可利用特異性淋巴細(xì)胞亞群的表面標(biāo)志物，用 MACS 或 FACS 進(jìn)行陽(yáng)性分選。

注意事項(xiàng)

1. 人的血液可能受到 HIV 、肝炎病毒或其他病原體等的感染，在操作時(shí)應(yīng)當(dāng)特別小心。

   2. 不要用玻璃 Pasteur 吸管和帶有銳利針頭的注射器加注入的血液，但可用 1 ml 移液器或帶有鈍頭插管的注射器。

以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

安培生物科技有限公司介紹：

安培生物堅(jiān)持為生命科學(xué)研究、活體動(dòng)物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無(wú)動(dòng)物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺(tái)基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)